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name: Real-Time Fluorescent PCR Quantification
description: 对mRNA、miRNA、非编码RNA或DNA模板进行快速、准确、灵敏的核酸定量分析。当需要基于实时荧光信号测定初始模板拷贝数（如用于肿瘤诊断、病原体检测或基因表达分析）时使用本技能。
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# 实时荧光PCR定量分析

## 何时使用
- 需要对核酸样本（mRNA、miRNA、非编码RNA或DNA模板）进行绝对或相对定量
- 应用于临床诊断（如病原体载量检测）、基因表达差异分析、SNP分型等场景
- 具备专用实时PCR仪及荧光染料或探针

## 执行步骤
1. **构建反应体系**：在PCR反应中加入荧光染料（如SYBR Green）或荧光标记探针（如TaqMan探针）。
2. **运行扩增程序**：使用专用实时PCR仪，在每个循环的特定阶段自动采集荧光强度，生成实时扩增曲线。
3. **确定Ct值**：记录荧光信号超过设定阈值所需的循环数（Ct值），该值与初始模板拷贝数呈负相关。
4. **选择定量方法**：
   - **非引物探针类（如SYBR Green）**：适用于成本敏感、单靶标检测；注意验证引物特异性以避免假阳性。
   - **引物探针类（如TaqMan、分子信标）**：适用于高特异性或多靶标同步检测；需预先设计靶序列特异性探针。
5. **计算初始模板量**：基于标准曲线或ΔΔCt法，将Ct值转换为初始模板的绝对或相对拷贝数。

## 注意事项
- 普通无荧光检测功能的PCR仪不可用
- SYBR Green法对引物特异性要求极高，建议通过熔解曲线验证扩增产物单一性
- 探针法虽特异性高，但成本较高且设计复杂

输出结果可用于比较不同样本中目标核酸的表达水平或载量。