---
name: GST标签蛋白牵拉沉淀实验
description: 用于体外验证两种蛋白质之间是否存在直接物理相互作用，或从复杂样品中筛选与目标蛋白结合的互作蛋白。当需要确认蛋白X与蛋白Y是否直接结合、分析互作结构域或从cDNA表达文库中捕获未知互作伙伴时使用本技能。
---

# GST标签蛋白牵拉沉淀实验

## 适用场景
- 验证两个已知蛋白是否存在直接物理结合
- 筛选与目标蛋白相互作用的未知蛋白
- 定位蛋白相互作用的关键结构域（通过截短突变体）
- 纯化GST融合蛋白及其复合物

## 前提条件
- 已构建GST-目标蛋白融合表达载体
- 已在大肠埃希菌中表达并获得GST融合蛋白
- 已准备含潜在互作蛋白的样品（纯化蛋白或细胞裂解液）

## 实验步骤
1. 将GST-目标蛋白融合蛋白与偶联还原型谷胱甘肽（GSH）的琼脂糖珠孵育，使GST部分特异性结合至珠上。
2. 加入含潜在互作蛋白的样品，在温和缓冲条件下温育，允许目标蛋白与其互作伙伴结合。
3. 多次洗涤琼脂糖珠，去除未结合及非特异性吸附的蛋白。
4. 使用含游离GSH的洗脱缓冲液竞争性洗脱，释放GST融合蛋白及其结合的互作蛋白。
5. 对洗脱产物进行SDS-PAGE电泳并染色或免疫印迹检测。
6. 若在预期分子量位置观察到互作蛋白条带，则判定为阳性结果，表明存在直接物理相互作用。

## 注意事项
- 本方法仅适用于体外验证直接相互作用，不能反映细胞内动态互作过程。
- 必须设置阴性对照（如仅GST蛋白）以排除非特异性结合。
- 洗涤条件需温和，避免破坏弱相互作用；但也不能过弱，以免背景过高。